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一種通過改造CHO 細(xì)胞提升抗體產(chǎn)量的新技術(shù)

丙酮酸羧化酶是細(xì)胞質(zhì)和線粒體代謝途徑的重要元素，可以有效促進(jìn)能量代謝。在CHO細(xì)胞中過表達(dá)酵母胞質(zhì)丙酮酸羧化酶(PYC2)，可以增加丙酮酸流向TCA循環(huán)。增強(qiáng)的PYC2表達(dá)導(dǎo)致丙酮酸通量增加，從而使乳酸積累減少多達(dá)4倍，并顯著增加細(xì)胞密度和培養(yǎng)壽命。有了這個結(jié)果，與親本細(xì)胞相比，工程細(xì)胞的抗體表達(dá)顯著提高了70%，產(chǎn)品質(zhì)量也有所提高（約3倍）。通過PYC2工程改造提升細(xì)胞性能，在丙酮酸、葡萄糖、乳酸和細(xì)胞能量代謝方面具有均高于親代細(xì)胞的各種優(yōu)勢。PYC2工程改造原理和方法在補(bǔ)...

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核酸酶切反應(yīng)原理及注意事項

A載體和外源DNA的酶切一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握核酸的酶切操作原理；通過酶切獲得可進(jìn)行體外重組的載體和外源DNA。二、實驗原理限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。絕大多數(shù)限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列：5'-G↓AATTC-3')，有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'...

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質(zhì)粒DNA的提取實驗方法和步驟

質(zhì)粒DNA的提取實驗方法和步驟一、實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的原理和步驟。二、實驗原理從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)胞：分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可以破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基磺酸鈉(SDS)和TritonX-100可使細(xì)胞膜裂解。經(jīng)溶菌酶和SDS或TritonX-100處理后，細(xì)菌染色體DNA會纏繞附著在細(xì)胞碎片上，同時由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多，易受機(jī)械力和核酸酶等的作用而被切斷成不同大小的線性...

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PCR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)

一、實驗?zāi)康模赫莆誔CR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)二、PCR反應(yīng)實驗原理PCR(PolymeraseChainReaction)-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可以選擇性擴(kuò)增一段DNA序列。其基本步驟是，首先將待擴(kuò)增的模板DNA變性使之成為單鏈，DNA樣品中，特異性的引物能夠與其互補(bǔ)的序列雜交，在dNTPs和Taq酶存在時，就可以合成模板DNA的互補(bǔ)鏈，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物加熱使DNA雙鏈變性，溫度下降后，過量的引物又可以開始第二輪的合成反應(yīng)。這種延伸-變性-退火-延伸的循環(huán)可以重復(fù)多次...

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瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法

一、實驗?zāi)康模和ㄟ^本實驗學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)。二、實驗原理DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷在電場中向正極移動。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度...

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