作為每天要幫實驗室客戶解決各種 Transwell 問題的實驗耗材供應商，我見過太多同學因為操作細節(jié)沒把控好，明明細胞狀態(tài)沒問題，最后卻得不到能用的數(shù)據(jù) —— 要么膜上細胞太少，要么下室細胞污染，甚至連 Transwell 小室怎么放都能搞錯。

其實細胞遷移實驗本身不復雜，但90% 的失敗都藏在 “不起眼" 的細節(jié)里。今天就從 “耗材準備 - 細胞處理 - 實驗操作 - 結(jié)果統(tǒng)計" 全流程，把我總結(jié)的實操要點和避坑經(jīng)驗分享給大家，新手照著做，基本能一次出有效數(shù)據(jù)。

一、實驗前：耗材和試劑準備，這些 “預處理" 別省

很多人拿到 Transwell 小室就直接用，其實第一步 “預處理" 沒做好，后續(xù)再努力也白費。先明確：我們常用的 Transwell 小室（遷移實驗用無基質(zhì)膠的，侵襲實驗才加 Matrigel），核心是聚碳酸酯膜（孔徑一般選 8μm，除非細胞特別大 / 小，比如神經(jīng)元可能用 12μm），實驗耗材膜的處理和試劑配比是關鍵。

1. Transwell 小室的預處理：別讓 “氣泡" 毀了實驗

• 第一步：激活膜的親水性

新的小室膜是疏水的，細胞沒法附著遷移，必須先用水或培養(yǎng)基浸潤激活。操作時用無菌槍頭吸取無血清培養(yǎng)基（或 PBS），緩慢加到小室內(nèi)部（膜上方），注意別戳到膜！加完后放在培養(yǎng)板孔里，室溫靜置 20-30 分鐘，讓膜充分吸水變親水。

? 避坑：別用血清培養(yǎng)基激活！血清里的蛋白會提前吸附在膜上，反而影響細胞遷移。

• 第二步：去除膜上殘留液體

激活后，用無菌吸頭輕輕吸掉小室內(nèi)部的培養(yǎng)基（動作要輕，別把膜吸破），再把小室倒扣在無菌濾紙上吸 10 秒，把膜上多余的液體吸干 —— 殘留液體太多，會導致上室細胞懸液被稀釋，影響細胞密度。

2. 試劑配比：血清濃度是 “遷移動力"，別亂加

Transwell 遷移的原理是 “趨化作用"：下室的血清（營養(yǎng)）吸引上室的細胞穿過膜，所以上下室的血清濃度差是關鍵，配比錯了細胞根本不遷移。

• 上室：無血清培養(yǎng)基（或含 0.1%-0.5% 血清，避免細胞饑餓過度，但濃度絕對不能高于下室）

• 下室：含 10%-20% 血清的培養(yǎng)基（根據(jù)細胞類型調(diào)整，比如腫瘤細胞用 10% 足夠，成纖維細胞可能需要 20%）

?? 重點：下室加培養(yǎng)基時，要先加到培養(yǎng)板孔里，再放入預處理好的小室，避免小室下方產(chǎn)生氣泡 —— 氣泡會頂住膜，細胞穿不過去，最后下室沒細胞，白做！

二、細胞處理：狀態(tài)比數(shù)量更重要，這 3 步別錯

很多同學糾結(jié) “上室加多少細胞"，其實比數(shù)量更重要的是細胞狀態(tài)—— passages 太多、有污染、貼壁不牢的細胞，遷移能力會差很多，數(shù)據(jù)根本不可信。

1. 細胞消化：別消化過度，避免損傷細胞膜

• 用胰酶消化時，看到細胞邊緣收縮、輕輕吹打能散開就停，立刻加含血清的培養(yǎng)基終止消化（血清能中和胰酶）

• 別用槍頭猛吹，避免細胞破裂 —— 破裂的細胞會沉在膜上，最后計數(shù)時會算成 “遷移細胞"，導致數(shù)據(jù)偏高。

2. 細胞計數(shù)：調(diào)整濃度，保證膜上細胞均勻

• 消化后的細胞離心（1000rpm，5 分鐘），棄上清，用無血清培養(yǎng)基重懸（和上室培養(yǎng)基一致），吹成單細胞懸液

• 計數(shù)后調(diào)整濃度：一般上室加 2-5×10?個細胞 / 孔（24 孔板），具體看細胞大小 —— 比如 A549 細胞小，加 5×10?；HCT116 細胞大，加 2×10?。

? 技巧：如果不確定濃度，先做預實驗（比如設 2、4、6×10?三個梯度），選 “24 小時后膜上還有少量未遷移細胞，下室有明顯遷移細胞" 的濃度。

3. 上室加樣：別讓細胞堆積在中間

• 加細胞懸液時，槍頭貼著小室內(nèi)壁緩慢加（別直接滴在膜上），加完后輕輕晃一下小室，讓細胞均勻分布在膜上

• 上室液體體積：24 孔板的小室，一般加 200μL（別加滿，留一點空間，避免液體溢出到下室）

• 加完后把培養(yǎng)板放進孵箱，前 30 分鐘別碰—— 讓細胞先貼在膜上，避免移動導致細胞聚堆。

三、孵育和染色：時間別亂定，染色步驟要 “輕"

孵育時間和染色方法，直接影響最后能不能清晰計數(shù)，新手常在這里踩坑。

1. 孵育時間：根據(jù)細胞類型定，別盲目跟文獻

• 大多數(shù)腫瘤細胞（如乳腺癌、肺癌細胞）孵育 24 小時足夠；成纖維細胞遷移快，12-16 小時就夠；內(nèi)皮細胞慢，可能需要 36 小時

• 怎么判斷時間到了？可以在孵箱里觀察：用顯微鏡看小室膜下方，有明顯細胞附著就可以終止，別孵育太久 —— 否則下室細胞太多，會重疊在一起，沒法計數(shù)。

2. 固定和染色：別把膜弄破，別漏染

• 第一步：棄液

取出小室，先倒掉上室的培養(yǎng)基，再用 PBS 輕輕洗 2 次（別用勁沖，避免把膜上的細胞沖掉）

• 第二步：固定

用 4% 多聚甲醛（PFA）加滿上室，室溫固定 20 分鐘（固定是為了讓細胞貼在膜上，后續(xù)染色不會掉）

• 第三步：染色

棄掉 PFA，用 PBS 洗 2 次，然后加 0.1% 結(jié)晶紫染液（過濾后用，避免有雜質(zhì)），室溫染 15-20 分鐘 —— 結(jié)晶紫是細胞核染色，顏色深，計數(shù)清晰。

? 避坑：染色后一定要用 PBS 輕輕洗去多余染液，直到洗出的水變清 —— 否則背景顏色太深，細胞和膜分不清。

3. 擦去上室未遷移細胞：這步是 “數(shù)據(jù)準確" 的關鍵

• 染色后，用無菌棉簽（或細胞刮子）輕輕擦去小室上表面的細胞（這些是沒遷移過去的），擦的時候要順著一個方向，別來回蹭 —— 避免把膜擦破，或者把下表面的遷移細胞擦掉。

• 擦完后可以在顯微鏡下看一眼：上表面沒殘留細胞，下表面有紫色的細胞，就說明擦干凈了。

四、結(jié)果統(tǒng)計：別只數(shù) 1 個視野，這樣才客觀

很多人隨便找個視野數(shù)細胞，最后數(shù)據(jù)波動大，審稿人根本不認可。正確的統(tǒng)計方法，要保證 “隨機性" 和 “重復性"。

1. 拍照：選 5 個固定視野，避免主觀選擇

• 這個步驟一般用不到那種精密的實驗室儀器，我們把小室放在生物顯微鏡下，用 10× 物鏡（視野大，計數(shù)方便），拍上、下、左、右、中 5 個視野（每個視野間距盡量一致），別只拍細胞多的地方 —— 否則數(shù)據(jù)偏高，不客觀。

• 拍照時保持曝光一致：同一個實驗的所有樣本，曝光時間、焦距都要一樣，避免后續(xù)分析時因亮度不同導致計數(shù)誤差。

2. 計數(shù)：手動計數(shù) + 軟件分析，雙重驗證

• 手動計數(shù)：用 ImageJ 軟件打開圖片，用 “Cell Counter" 插件，逐個視野數(shù)細胞（紫色的細胞核都算），5 個視野取平均值

• 軟件分析：如果樣本多，可以用 ImageJ 的 “Threshold" 功能，設置合適的閾值（把細胞和背景分開），然后用 “Analyze Particles" 自動計數(shù)，最后和手動計數(shù)對比，誤差在 10% 以內(nèi)就可以用。

?? 注意：如果細胞重疊太多（比如孵育時間太長），自動計數(shù)會不準，必須手動計數(shù)，或者在染色前用胰酶把下室的細胞消化下來，用流式細胞儀計數(shù)（更準確，但步驟多）。

3. 重復實驗：至少 3 次獨立重復，別偷懶

• 單個樣本做 3 個復孔（比如對照組 3 孔，處理組 3 孔），然后至少做 3 次獨立實驗（不同天做），最后用 “平均值 ± 標準差（SD）" 表示數(shù)據(jù)，用 t 檢驗或 ANOVA 做統(tǒng)計分析 —— 這樣數(shù)據(jù)才有統(tǒng)計學意義，審稿人才會認可。

五、常見問題排查：做不出數(shù)據(jù)？先看這 5 點

最后總結(jié)幾個客戶常問的問題，幫大家快速定位問題所在：

     其實 Transwell 遷移實驗，只要把 “膜的預處理、血清濃度差、細胞狀態(tài)、計數(shù)方法" 這幾個關鍵點把控好，就能穩(wěn)出數(shù)據(jù)。如果還有其他問題，比如不知道選哪種孔徑的小室，或者需要匹配特定細胞的實驗耗材，也可以進入蘇州阿爾法生物咨詢我 —— 畢竟我們每天和這些實驗耗材打交道，對不同細胞的適配性還是很熟的。

最后提醒一句：實驗過程中做好記錄（比如細胞濃度、孵育時間、染色時間），下次再做就能直接復用參數(shù)，不用再從頭摸索啦～