在 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)中，常用的分子生物學(xué)試劑按實(shí)驗(yàn)流程可分為載體構(gòu)建、gRNA 制備、細(xì)胞遞送、編輯檢測、篩選與修復(fù)五大核心環(huán)節(jié)，以下是常用到的生物試劑：
一、載體構(gòu)建階段
1. 限制性內(nèi)切酶
作用：切割質(zhì)粒載體和目的 DNA 片段，用于 gRNA 表達(dá)盒或 Cas9 表達(dá)載體的組裝。
常用酶：
BsaI：識別非常規(guī)回文序列（如 GGTCTC），切割后產(chǎn)生黏性末端，適用于 Golden Gate 克隆法，批量組裝 gRNA 表達(dá)單元（尤其適用于 CRISPR 文庫構(gòu)建）。
EcoRI、HindIII：傳統(tǒng)限制性內(nèi)切酶，比如百時(shí)美的EG15536S常用于質(zhì)粒線性化（如 pUC19、pSpCas9 載體）。
AgeI、AscI：稀有切點(diǎn)酶，減少載體內(nèi)部酶切位點(diǎn)干擾，提高克隆效率。
應(yīng)用場景：載體酶切→目的片段插入→連接反應(yīng)（需配合 T4 DNA 連接酶）。
2. DNA 連接酶
T4 DNA 連接酶：連接酶切后的載體與 gRNA 片段，形成重組質(zhì)粒。
Gibson 組裝試劑盒：基于同源重組的無縫克隆技術(shù)，無需酶切位點(diǎn)，直接拼接多個(gè) DNA 片段（如 Cas9 表達(dá)盒與 gRNA 陣列）。
3. 質(zhì)粒提取與純化試劑
質(zhì)粒小提試劑盒（如 Qiagen Miniprep）：從大腸桿菌中提取重組質(zhì)粒，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染或測序驗(yàn)證。
二、gRNA 設(shè)計(jì)與制備
1. gRNA 寡核苷酸合成
DNA 寡核苷酸：合成 gRNA 的 crRNA（靶向序列）和 tracrRNA 互補(bǔ)鏈，通常含 20nt 靶向序列 + PAM 鄰近序列（如 NGG）。
磷酸化試劑：如 T4 多核苷酸激酶（PNK），對寡核苷酸 5' 端磷酸化，提高連接效率。
2. 體外轉(zhuǎn)錄（IVT）試劑
RNA 聚合酶：如 T7 RNA 聚合酶，以 DNA 為模板轉(zhuǎn)錄 gRNA（需含 T7 啟動(dòng)子序列），適用于體外合成 sgRNA（單鏈 gRNA）。
RNA 純化試劑盒（如 RNA Clean & Concentrator）：去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的 DNA 模板和雜質(zhì)，獲得高純度 sgRNA。
3. 引物與 PCR 試劑
PCR 引物：擴(kuò)增 gRNA 表達(dá)盒（如 U6 啟動(dòng)子 + gRNA 序列），或用于載體構(gòu)建中的序列驗(yàn)證（如菌落 PCR）。
高保真 DNA 聚合酶（如 Q5、KOD）：確保擴(kuò)增序列無突變，尤其在構(gòu)建 CRISPR 文庫時(shí)避免靶向誤差。
| 實(shí)驗(yàn)流程 | 核心模塊 | 關(guān)鍵試劑 / 技術(shù) | 具體功能與應(yīng)用場景 | 可視化標(biāo)簽 |
|---|---|---|---|---|
| 載體構(gòu)建 | 限制性內(nèi)切酶 | BsaI、EcoRI、AgeI、AscI | - BsaI：Golden Gate 克隆法，批量組裝 gRNA 表達(dá)單元（適用于 CRISPR 文庫） - 稀有酶（AgeI/AscI）：減少載體內(nèi)部酶切干擾 | ?? 酶切工具 |
| DNA 連接與組裝 | T4 DNA 連接酶、Gibson 組裝試劑盒 | - T4 連接酶：黏性末端連接載體與目的片段 - Gibson 組裝：無縫克?。o需酶切位點(diǎn)，拼接多片段如 Cas9+gRNA 陣列） | ?? 連接工具 | |
| 質(zhì)粒操作 | 質(zhì)粒小提試劑盒、Q5 高保真聚合酶 | - 提取重組質(zhì)粒（Qiagen Miniprep） - 菌落 PCR 驗(yàn)證（高保真酶確保無突變，尤其文庫構(gòu)建） | ?? 質(zhì)粒工程 | |
| gRNA 制備 | 序列設(shè)計(jì) | 20nt 靶向寡核苷酸（含 PAM）、T4 PNK 激酶 | - 合成 crRNA/tracrRNA 互補(bǔ)鏈，5' 端磷酸化提高連接效率 - 靶向序列需避開脫靶位點(diǎn)（如使用 E-CRISP 數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)） | ?? 靶向序列設(shè)計(jì) |
| 合成技術(shù) | IVT 試劑盒（T7 聚合酶）、PAGE 純化 sgRNA | - 體外轉(zhuǎn)錄：T7 聚合酶 + DNA 模板（含 T7 啟動(dòng)子）合成 sgRNA - 化學(xué)合成：高純度 sgRNA（適用于 RNP 復(fù)合物遞送） | ?? RNA 合成 | |
| 細(xì)胞遞送 | 體外遞送 | 脂質(zhì)體（Lipofectamine 3000）、電轉(zhuǎn)染試劑 | - 脂質(zhì)體：貼壁細(xì)胞（HEK293T/HeLa）高效轉(zhuǎn)染 - 電轉(zhuǎn)儀：原代細(xì)胞 / 難轉(zhuǎn)染細(xì)胞（如 T 細(xì)胞、干細(xì)胞） | ?? 體外遞送 |
| 體內(nèi)遞送 | 慢病毒 / AAV 載體系統(tǒng)、輔助包裝質(zhì)粒 | - 慢病毒：感染分裂 / 非分裂細(xì)胞（如神經(jīng)元），穩(wěn)定整合 - AAV：肝臟 / 肌肉靶向（SaCas9 因體積小適合 AAV 包裝） | ?? 病毒載體 | |
| 蛋白遞送 | 重組 Cas9 蛋白（如 SpCas9-NLS）、RNP 復(fù)合物 | - 核定位信號修飾 Cas9，與 sgRNA 組裝成 RNP - 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染降低脫靶（避免質(zhì)粒整合風(fēng)險(xiǎn)，適用于原代細(xì)胞） | ?? 蛋白復(fù)合體 | |
| 編輯檢測 | 分子水平驗(yàn)證 | T7E1 酶 / Surveyor 核酸酶、Sanger/NGS 測序 | - 酶切錯(cuò)配 DNA 檢測 Indels（凝膠電泳初步篩選） - 高通量測序定量脫靶率（如 Illumina TruSeq 建庫） | ?? 突變檢測 |
| 細(xì)胞水平分析 | 熒光報(bào)告載體（GFP/mCherry）、FACS 分選 | - 報(bào)告載體：評估基因敲除 / 激活效率（如破壞 GFP 開放閱讀框） - 流式分選：富集陽性編輯細(xì)胞（無抗生素篩選場景） | ?? 細(xì)胞篩選 | |
| 篩選與修復(fù) | 陽性克隆篩選 | 抗生素（Puro/G418）、抗性基因載體 | - 穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建：載體攜帶抗性基因，抗生素篩選單克隆 - 配合有限稀釋法獲得純合敲除細(xì)胞 | ?? 篩選標(biāo)記 |
| 精準(zhǔn)修復(fù)（HDR） | ssODN（同源臂 100-200nt）、雙鏈 DNA 供體質(zhì)粒 | - ssODN：點(diǎn)突變修復(fù)或小片段插入（化學(xué)合成，PAGE 純化） - 雙鏈質(zhì)粒：大片段基因敲入（如熒光蛋白基因） | ? 同源修復(fù)模板 | |
| 堿基編輯 | BE3/ABE 系統(tǒng)（脫氨酶 + Cas9n）、UGI 抑制劑 | - BE3：C→T 單堿基編輯（需 UGI 保護(hù)尿嘧啶不被修復(fù)） - ABE：A→G 編輯（TadA 脫氨酶變體，無 DSB 風(fēng)險(xiǎn)） | ?? 單堿基編輯工具 | |
| 輔助系統(tǒng) | 細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化 | ROCK 抑制劑（Y-27632）、干細(xì)胞培養(yǎng)基 | - 提高干細(xì)胞轉(zhuǎn)染后存活率 - 無血清培養(yǎng)基維持原代細(xì)胞狀態(tài) | ?? 細(xì)胞培養(yǎng)支持 |
| 高通量篩選 | CRISPR 文庫（GeCKO/Achilles）、慢病毒包裝 | - 全基因組 gRNA 文庫篩選關(guān)鍵基因（如癌癥耐藥基因） - 配合 NGS 分析富集 / 耗竭靶點(diǎn) | ?? 功能基因組篩選 |
三、細(xì)胞遞送與編輯
1. 轉(zhuǎn)染試劑
脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑：如 Lipofectamine 3000、JetPrime，將重組質(zhì)?；?nbsp;sgRNA/Cas9 核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物導(dǎo)入細(xì)胞（適用于貼壁細(xì)胞，如 HEK293T、HeLa）。
電轉(zhuǎn)染試劑盒：如 Nucleofector 電轉(zhuǎn)儀配套試劑，適用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞（原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞）。
病毒包裝試劑：
慢病毒包裝質(zhì)粒（psPAX2、pMD2.G）：包裝 Cas9/gRNA 載體，感染分裂或非分裂細(xì)胞（如神經(jīng)元）。
AAV 載體系統(tǒng)：含 AAV 反向末端重復(fù)序列（ITR）、Cas9 基因，用于體內(nèi)遞送（需輔助質(zhì)粒 pAAV-RC、pAAV Helper）。
2. Cas9 蛋白與 RNP 復(fù)合物
重組 Cas9 蛋白：如 SpCas9-NLS（核定位信號修飾），與 sgRNA 體外組裝成 RNP，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)（避免質(zhì)粒整合）。
蛋白酶抑制劑：如 PMSF，在蛋白純化過程中保護(hù) Cas9 不被降解。
四、編輯效率檢測
1. PCR 與測序試劑
Taq PCR 試劑盒：擴(kuò)增編輯位點(diǎn)上下游 DNA，用于 Sanger 測序（檢測 Indels）或 TA 克隆后測序（分析突變頻率）。
高通量測序建庫試劑：如 Illumina TruSeq DNA Kit，對大量樣本進(jìn)行深度測序，定量脫靶效應(yīng)。
2. 錯(cuò)配切割酶
T7E1 核酸酶/ Surveyor 核酸酶：識別編輯后 DNA 雙鏈錯(cuò)配位點(diǎn)并切割，通過凝膠電泳檢測突變效率（適用于初步篩選）。
3. 熒光定量試劑
qPCR 試劑盒：檢測報(bào)告基因（如 GFP）的表達(dá)變化，評估基因敲除 / 激活效率（需構(gòu)建熒光報(bào)告載體，如 Cas9-dCas9 融合激活系統(tǒng)）。
五、篩選與修復(fù)過程
1. 篩選標(biāo)記試劑
抗生素：如嘌呤霉素（Puro）、G418（Neomycin），篩選穩(wěn)定整合 Cas9/gRNA 載體的細(xì)胞克?。ㄐ栎d體攜帶抗性基因）。
流式細(xì)胞儀（FACS）：分選表達(dá)熒光標(biāo)記（如 mCherry）的陽性細(xì)胞，適用于無抗生素篩選的場景。
2. HDR 供體模板
單鏈寡核苷酸（ssODN）：含同源臂的修復(fù)模板，用于精確基因敲入（如點(diǎn)突變修復(fù)），需化學(xué)合成并經(jīng) PAGE 純化。
雙鏈 DNA 質(zhì)粒：作為 HDR 供體，攜帶大片段外源基因（如熒光蛋白基因），需配合 Cas9 切割誘導(dǎo)同源重組。
3. 堿基編輯相關(guān)試劑
脫氨酶融合蛋白：如胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）或腺嘌呤脫氨酶（TadA），與 Cas9n（切口酶）結(jié)合，實(shí)現(xiàn)單堿基編輯（如 BE3、ABE 系統(tǒng)），無需 DSB 即可完成 C→T 或 A→G 替換。
尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）：保護(hù)編輯過程中產(chǎn)生的尿嘧啶不被修復(fù)，提高堿基編輯效率（常見于胞嘧啶堿基編輯器）。
六、輔助試劑與系統(tǒng)優(yōu)化
1. 細(xì)胞培養(yǎng)試劑
培養(yǎng)基與添加劑：如 DMEM、胎牛血清（FBS），維持細(xì)胞狀態(tài)；ROCK 抑制劑（Y-27632）提高干細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的存活率。
細(xì)胞裂解液：如 RIPA 緩沖液，提取細(xì)胞蛋白用于 Western blot 檢測 Cas9 表達(dá)。
2. 基因編輯工具盒
CRISPR 文庫篩選試劑盒：如 Broad Institute 的 GeCKO 文庫，包含靶向全基因組的 gRNA 陣列，用于功能基因篩選（需配合慢病毒包裝試劑）。
CRISPR 激活 / 抑制系統(tǒng)：dCas9-VPR（激活）或 dCas9-KRAB（抑制）質(zhì)粒，搭配 sgRNA 實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，需啟動(dòng)子區(qū)域靶向 gRNA。
試劑分類與應(yīng)用流程圖
實(shí)驗(yàn)流程 核心試劑 作用
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載體構(gòu)建 限制性內(nèi)切酶（BsaI、EcoRI）、T4連接酶 切割/連接gRNA/Cas9載體
gRNA制備 IVT試劑盒（T7聚合酶）、DNA寡核苷酸 合成sgRNA
細(xì)胞遞送 轉(zhuǎn)染試劑（脂質(zhì)體/電轉(zhuǎn)）、病毒包裝質(zhì)粒 導(dǎo)入細(xì)胞/體內(nèi)遞送
編輯檢測 T7E1酶、PCR試劑、測序試劑盒 評估突變效率與脫靶
篩選修復(fù) 抗生素、ssODN供體、堿基編輯器組分 篩選陽性細(xì)胞/精確修復(fù)
輔助優(yōu)化 細(xì)胞培養(yǎng)基、CRISPR文庫、蛋白酶抑制劑 系統(tǒng)優(yōu)化與功能擴(kuò)展
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實(shí)驗(yàn)試劑選擇策略與注意事項(xiàng)：
遞送效率：原代細(xì)胞先選電轉(zhuǎn)或病毒載體，貼壁細(xì)胞可用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。
檢測精度需求：初步篩選用 T7E1 酶，精準(zhǔn)分析需高通量測序。
修復(fù)類型選擇：基因敲除依賴 NHEJ（無需供體），精確編輯需 HDR（需 ssODN/dsDNA 供體）。
安全性考量：RNP 復(fù)合物（蛋白 + sgRNA）可減少質(zhì)粒整合風(fēng)險(xiǎn)，適用于醫(yī)學(xué)研究。
蘇州阿爾法生物作為百時(shí)美的聯(lián)盟供應(yīng)商提供實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備， 實(shí)驗(yàn)耗材，生物試劑的一站式服務(wù)，所提供的分子生物學(xué)試劑主要包括：限制性內(nèi)切酶 ，taq聚合酶，逆轉(zhuǎn)試劑盒，熒光定量試劑、體外轉(zhuǎn)錄酶等。
